人類白細(xì)胞抗原 B27檢測方法及意義

HLA是組織細(xì)胞上受遺傳控制的個體特異性抗原，zui早是在白細(xì)胞和血小板上發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)該抗原廣泛分布于皮膚、腎、脾、肺、腸和心等組織器官有核細(xì)胞的細(xì)胞膜上。第8次組織相容性會議確定HLA有92個，分屬于A、B、C、D和DR5個位點(diǎn)，分別稱為HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-D和HLA-DR。HLA-B位點(diǎn)有42個，B27為其中之一?，F(xiàn)已證明HLA-B27陽性者比HLA-B27陰性者發(fā)生強(qiáng)直性脊柱炎的機(jī)會要大得多。

2 HLA B27檢測意義

臨床意義：強(qiáng)直性脊柱炎病人HLA-B27的陽性率為90%。瑞特綜合征的陽性率為80%。有報導(dǎo)說，HLA-B27陽性的正常人中大約有8%日后發(fā)展為強(qiáng)直性脊柱炎的可能。

3 本試劑盒采用檢測方法

本試劑盒采用TaqMan 的熒光PCR方法，結(jié)合序列特異性PCR(PCR-SSP)技術(shù)。從GenBank中選取已公布的所有HLA亞型，進(jìn)行序列比對后設(shè)計一對特異性引物和一條特異性熒光探針，既提高了檢測靈敏度、準(zhǔn)確性，又使檢測簡便快速，反應(yīng)結(jié)束后直接分析判讀，無需電泳檢測。

4 試劑盒性能參數(shù)

便捷性：本試劑盒采用堿裂解法提取外周血DNA，操作過程方便快捷，從提取到結(jié)果判斷全程耗時小于90分鐘，適用于市面上的多款熒光PCR儀。

準(zhǔn)確性：對檢測出150例陽性標(biāo)本進(jìn)行測序分析，準(zhǔn)確性達(dá)到100％。

靈敏度：zui低檢測約為1000 Copies/ml，對DNA的要求濃度低，線性范圍1×103-1×109，重現(xiàn)性好。

特異性：與One Lamda HLA B27試劑進(jìn)行比較，結(jié)果一致性達(dá)到99.4%(359/361)。

安全性：本試劑盒采用PCR－熒光探針技術(shù)，避免了PCR-SSP單一技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳EB染色，避免了致癌物質(zhì)接促及PCR產(chǎn)物污染等問題。

強(qiáng)直性脊柱炎B27檢測試劑盒（磁酶聯(lián)免疫法）

英文名稱：HLA-B27 Assay Kit

【包裝規(guī)格】

   48人份/盒

【簡 介】

    HLA-B27與強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）強(qiáng)相關(guān)。AS在我國的患病率為0.3%，其中90%-98%的患者出現(xiàn)HLA-B27陽性。因此，B27的檢測對排除AS的診斷有輔助作用并有助于早期發(fā)現(xiàn)B27抗原的存在，對于患者及早進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)措施具有指導(dǎo)意義。本試劑盒提供含有抗HLA-B27抗體的磁珠，特異性針對人白細(xì)胞抗原B27。

【預(yù)期用途】

    本試劑盒主要用于檢測人全血中B27抗原是否存在，作為強(qiáng)直性脊柱炎的鑒別診斷。

【檢驗原理】

    本試劑盒應(yīng)用磁珠分離法，在高品質(zhì)磁珠上耦聯(lián)B27抗體，與全血中白細(xì)胞上的B27抗原反應(yīng)，同時，加入HRP標(biāo)記的抗體聯(lián)結(jié)至白細(xì)胞上。經(jīng)洗滌后，磁珠上含有B27抗原的細(xì)胞和酶均被保留下來。加入底物液顯色，終止反應(yīng)后在酶標(biāo)儀450nm讀取吸光度值。

【主要組成成份】

本試劑盒包含以下組分：

1. MICROPLAT -包被抗體的微孔板條

（REF PC-01A）

孔內(nèi)包被HLA-B27磁珠的抗體，微孔板條6×8孔條，包裝于帶干燥劑的鋁箔袋中。

1. ENZYMCONJ-酶結(jié)合物（REF PC-01B）

含HRP標(biāo)記的抗細(xì)胞抗體，每瓶60µl。

1. ENZYMDIL-酶稀釋液（REF PC-01C）

用于稀釋酶結(jié)合物，每瓶3ml。

1. WASHBUF 20×—濃縮洗液（REF FC-01D）

含吐溫的磷酸緩沖液，每瓶10ml。

1. SUBSA -TMB底物液A（REF PC-SUBSA） 

每瓶3 ml。

1. SUBSA -TMB底物液B（REF PC-SUBSB） 

                         每瓶3 ml。

1. PC陽性對照品（REF PC-PC）

每瓶300 ul 。

1. PC陰性對照品（REF PC-NC）

每瓶300 ul。

1. STOP –終止液（REF PC-STOP）

每瓶3 ml。

10. 微孔板架          1個

11．文件              說明書1份

【儲存條件及有效期】

試劑盒儲存于2-8℃可保存至試劑盒上所標(biāo)示的zui后有效期日。

未使用完的微孔板條應(yīng)放回至有干燥劑的鋁箔袋中，將鋁箔袋折好并密封于塑料封口袋中，2-8℃下可保存8周。

洗液開封后在室溫下可保存8周。

【樣本采集和保存條件】

   EDTA-K3抗凝的全血樣本（靜脈采血），已打開過的、已污染的、已溶血的、已凝結(jié)的血液樣本可能引起不一致的測試結(jié)果，應(yīng)避免使用。不能立即使用的樣本應(yīng)靜置（豎立）保存于2-8ºC，不超過5天使用。

【額外需要的材料和設(shè)備】

1.  EDTA-K3抗凝管

2.  可調(diào)微量移液槍0.5-10ul，20-200ul，八道加樣槍和槍頭

3.  磁板（可重復(fù)使用）

4.  振蕩器

5.  計時器

6.  能夠測量波長為450nm的酶標(biāo)儀

7.  去離子水

8.  真空負(fù)壓泵（可選項，洗板時使用，有助于實(shí)現(xiàn)洗板*）

【檢驗方法】
試劑準(zhǔn)備

1. 取出所有試劑和待測樣本，平衡至室溫。
2. 對樣本、陽性對照品、陰性對照品進(jìn)行編號并記錄。
3. 取出所需微孔板條，其余放回密封袋中封好， 2-8℃保存。
4. 將酶結(jié)合物60 ul加入至酶稀釋液中，確保充分混勻?；靹蚝蟮娜芤悍Q為酶結(jié)合物溶液。
5. 用去離子水或蒸餾水稀釋濃縮洗液（20：1）。室溫下保存。

檢測步驟

1.   加入酶結(jié)合物溶液50ul至每一微孔中，輕拍板架，使磁珠分散。
2.   將抗凝管（EDTA-K3）輕輕顛倒混勻數(shù)次， 按記錄單中的安排分別加入樣本、陽性對照品、陰性對照品各50ul。輕拍板架數(shù)次，使磁珠和樣本充分混勻。
3.   將板架放置于振蕩器上（200轉(zhuǎn)/分鐘），室溫下反應(yīng)10-15分鐘。
4.   加入洗液250ul后，將板架置于磁板上靜置2
     分鐘（一定要等散開的磁珠被磁板吸附到底
     部）， 再甩板或采用真空負(fù)壓泵吸取液體。
     注意：采用真空負(fù)壓泵吸出洗液后，把板架從
     磁板上取下，用手輕叩板架邊緣數(shù)次，看到磁
     珠散開后，再加入洗液，每次清洗皆如此重復(fù)。
5.   每孔再加入洗液250ul。利用加入時的沖擊力使磁珠分散，如發(fā)現(xiàn)有聚團(tuán)，輕拍板架使磁珠分散。將板架放于磁板上，靜置2分鐘。再甩板或采用真空負(fù)壓泵吸取液體。
6.   重復(fù)5步驟共4次。
7.   每孔加入底物A液、B液各50uL。輕拍板架使之充分混合后，室溫下避光放置15分鐘。

注：底物液易受污染，僅移取檢測時所需的量，未用完的底物液須丟棄。

1.   每孔加入終止液50uL。
2.   將板架置于磁板上，使磁珠吸于微孔側(cè)壁。
3.   輕輕取下板架，在30分鐘內(nèi)將板架置于波長
     450nm下，讀取吸光度值（OD）。
    

【參考值（參考范圍）】
每個實(shí)驗室應(yīng)建立自己的參考范圍。

1. 陽性：樣本 OD值≥0.8。
2. 陰性：樣本 OD值≤0.4。

【檢驗結(jié)果的解釋】

OD值在0.4-0.8，請重復(fù)實(shí)驗，必要時用其它方法驗證。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

批內(nèi)差異：≤15%

批間差異：≤15％

準(zhǔn)確性：檢測陰性和陽性對照吸光度，測試結(jié)果應(yīng)在其允許范圍內(nèi)。

【檢驗方法的局限性】

診斷結(jié)果應(yīng)結(jié)合患者的臨床癥狀和醫(yī)師其他的實(shí)驗室的檢查進(jìn)行分析。

【注意事項】

1. 本試劑盒僅供人體外診斷，不得內(nèi)用，須嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。因未按說明書要求操作引起的損失及責(zé)任公司不予承擔(dān)。
2. 本試劑盒包含人和/或動物來源的材料。盒中試劑應(yīng)作為有潛在傳染性因子來處理。儲藏、操作和處理試劑應(yīng)有適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施和良好的實(shí)驗室操作。試劑的處理應(yīng)符合當(dāng)?shù)胤睢?/span>
3. 終止液對眼睛和皮膚有刺激。如不慎與眼接觸, 立刻以大量的水清洗，并尋求專業(yè)醫(yī)師幫助。操作本試劑盒時請穿戴適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)服和手套。
   1. 底物對皮膚接觸或吞咽都是有害的，應(yīng)穿戴

適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)服和手套。