真核細(xì)胞總RNA的提取與鑒定

 【原理】

RNA的制備與分析對于了解基因表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)是*的，也是zui常使用的通過cDNA途徑分析細(xì)胞基因表達(dá)的前提。通常一個(gè)典型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞約含10-5μg RNA，但其中大部分為rRNA及由tRNA，而mRNA僅占1%～5%。雖然mRNA大小和序列各不相同，但在多數(shù)真核細(xì)胞mRNA的3’末端都帶有一段較長的多腺苷酸鏈。這個(gè)群體編碼了所有由該細(xì)胞合成的多肽。RNA分析其實(shí)是對組織細(xì)胞總RNA中的mRNA進(jìn)行分析。zui常用的方法主要有:原位雜交、 RT-PCR、Northern ，另外還有: Sl 核酸酶作圖分析、引物延伸法等。在所有RNA實(shí)驗(yàn)中，zui關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于 RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，一般反應(yīng)不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實(shí)驗(yàn)中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要zui大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。在其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用的RNA酶也會(huì)造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。

防止RNA酶污染的措施

1．所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長時(shí)間。

2．塑料器皿可用01%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意:有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

3．有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。

4．配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1% DEPC在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng) 濾膜過濾除菌。

5．操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換。

6．設(shè)置RNA操作實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為。

常用的RNA酶抑制劑

1．焦磷酸二乙酯  是一種強(qiáng)烈但不*的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的瞇唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。

2．異硫氰酸胍  目前被認(rèn)為是zui有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。

3．氧釩核糖核昔復(fù)合物由氧化釩離子和核昔形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能*抑制RNA酶的活性。

4．RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）  從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。

5．其他  SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。

組織和細(xì)胞總RNA提取―異硫氰酸胍法

【操作】

1．樣品處理

（1）培養(yǎng)細(xì)胞  收集細(xì)胞1～2×10⁷ ，離心，5000g×5min。對于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至1Od離心管中；懸浮培養(yǎng)細(xì)胞可直接轉(zhuǎn)移離心管；離心， 5000g×5mim PBS洗滌2次。棄上清，置冰浴。加預(yù)冷變性液2ml，充分搖動(dòng)，使細(xì)胞裂解*。以下操作均在冰浴中進(jìn)行。

（2） 組織  取1～2g組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置組織勻漿器中，加入預(yù)冷的變性液12ml，在冰浴中充分勻漿。

總RNA定量

RNA定量方法與DNA定量相似RNA在260nm波長處有zui大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約 40μg/ml 的單鏈RNA。如用1cm光徑，用雙蒸水稀釋RNA樣品n倍并以雙蒸水為空白對照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260 值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度: RNA （mg/ml） = 40×OD260 讀數(shù)×稀釋倍數(shù)（n）/1000。RNA純品的OD260 /OD280 的比值為2.0，故根據(jù)OD260 /OD280 的比值可以估計(jì)RNA的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示RNA有降解。

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